Т-клеточный рецептор (ТКР). На поверхности эффекторных, иммунных Т-лимфоцитов имеются Т-клеточные рецепторы к антигену, по структуре напоминающие антитела. Т-клеточный рецептор является гетеродимером и состоит из альфа - и бета - (молекулярная масса 40-50 кОа) и, реже, из?/?-цепей (1-5%-клеток в крови). В эпителии кишечника и в коже преобладают Т-лимфоциты с?/? рецепторами. Они распознают антигены микобактерий и взаимодействуют с белком р65 теплового шока. Каждая цепь имеет вариабельный и постоянный участки-домены, подобные тем, что имеются у иммуноглобулинов. Учитывая это сходство, ТКР относят к суперсемейству иммуноглобулиновых рецепторов.
Вариабельные домены цепей образуют структуру, обеспечивающую распознавание антигена. ТКР прочно связан с СDЗ-комплексом, состоящим из 5-ти полипептидных цепей (гамма, дельта, эпсилон, дзета, тэта) который передает сигнал от рецептора внутрь клетки. Следовательно, вся TKP-CD3 структура функционирует как семипептидный комплекс. Варианты Т-клеточных рецепторов заранее предсуществуют для каждого антигена. Такое разнообразие рецепторов запрограммировано генетически (у эмбрионов, имеется 30-500 генов, контролирующих вариабельные домены цепей). Однако число генов, кодирующих Т-рецепторы и антитела невелико - около 1000. За синтез?-цепи ответственны гены, находящиеся в 14-й хромосоме, а синтез?-цепи определяется локусами минигенов V, D, J. Между ними, также как у генов иммуноглобулинов, наблюдаются рекомбинации, объединения, которые создают различные варианты рецепторов для многих антигенов. Рекомбинации генов вариабельных цепей приводят к появлению около 3000 вариантов а и 1000 вариантов b цепей и только 40 ? и 27 ?. Их различные ассоциации создают более 4 млн ТКР2 вариантов и 10000 ТКР1 антигенспецифических рецепторов Т-клеток. Антиген связывается с теми рецепторами, которые ему наиболее соответствуют и стимулирует деление соответствующих клеток. Эти клетки образуют большой клон. Т-хелперы взаимодействуют с антигеном, ассоциированным с собственными молекулами ГКГС-II класса, а Т-супрессоры распознают антиген в комплексе с молекулами ГКГС I класса. Причем антиген должен быть представлен в виде пептида длиной 9-11 аминокислот для Т-супрессоров и 12-25 для Т-хелперов, т. е. переварен антигенпредставляющими клетками. С обычными белками, полисахаридами, липидами ТКР не взаимодействует.
Эффекторные лимфоциты разных субпопуляций выделяют большое число различных медиаторов. Помимо интерлейкинов, это лимфокины - факторы хемотаксиса, факторы, подавляющие миграцию гранулоцитов и макрофагов, митогенные факторы и др.
Изучение процесса распознавания антигена В-клетками не вызвало особых экспериментальных осложнений. Легкость обнаружения мембранного иммуноглобулина у данного клеточного типа давала в руки исследователей основу для детального анализа явления. При этом поиск аналогичных структур у Т-клеток столкнулся с определенными трудностями. Использование тех же экспериментальных подходов, которые применялись при изучении антигенных рецепторов у В-клеток, не привело к положительным результатам. Первые шаги к решению проблемы были сделаны, как это ни странно, не в молекулярной иммунологии, а в клеточной - в экспериментах с генетически отличающимися клетками, взаимодействующими in vitro.Первоначально в гипотетической, на основании клеточной феноменологии, а затем в экспериментально хорошо документированной форме с использованием методов молекулярной биологии было установлено, что Т-клеточный рецептор распознает не собственно чужеродный антиген, а его комплекс с белками, контролируемыми главным комплексом гистосовместимости (МНС).
Основные доказательства двойного распознавания: молекул I и II классов МНС и ассоциированного с ними антигенного пептида, получены Р. Цинкернагелем и П.Дохерти. Исследования этих ученых были отмечены присуждением Нобелевской премии по медицине за 1997 г.
Строение Т-клеточных антигенраспознающих рецепторов
Известно два типа Т-клеточных антигенраспознающих рецепторов: TCRaB и TCRyb (от англ. - Т cell receptor, TCR). Последний экспрессируется на минорной субпопуляции Т-клеток (Тyb), которые в небольшом количестве представлены в тимусе и на периферии - в селезенке, крови. В онтогенезе они предшествуют Т-клеткам с TCRaB (TaB). Для их созревания не требуется тимус, они способны к самовоспроизведению, принимают участие в антибактериальной защите, реагируя на углеводные компоненты. Филогенетически Тyb предшествовали ТaB.
Попытки выявить TCR с помощью антииммуноглобулиновых антител, как это было сделано при поиске антигенраспознающих структур у В-клеток, оказались безуспешными.
Идентифицировать TCR удалось только с применением моноклональных антител (мАТ) и клонированных линий Т-клеток. Некоторые клоноспецифические мАТ реагировали только с клонами, выделенными от предварительно иммунизированных животных. Внесение в культуру таких клонов, соответствующих по специфичности мАТ, подавляло способность клонированных Т-клеток распознавать антиген, использованный для иммунизации. Наличие подобных антигенспецифических мАТ обеспечило полноценное изучение антигенраспознающих структур Т-клеток.
Каждая функционально зрелая Т-клетка имеет около 3 104 TCR. Они представляют собой гетеродимер, построенный для большинства клеток из ос- и (3-цепей, ковалентно связанных между собой цистеиновым мостиком. Каждая цепь состоит из вариабельного V-домена и константного С-домена, гомологичных соответствующим доменам иммуноглобулинов. В структуре TCR представлен также шарнирный домен с цистеиновым остатком, который образует дисульфидный мостик, объединяющий а- и B-цепив единую молекулу.
На клеточной мембране TCR удерживается гидрофобной трансмембранной последовательностью аминокислотных остатков. Характерной чертой трансмембранного домена является присутствие в нем положительно заряженных аминокислотных остатков. Заканчивается каждая цепь коротким цитоплазматическим хвостом, погруженным в цитоплазму. Имеющиеся структурные различия между TCRu BCR не могут считаться определяющими, так как основное свойство - построение активного антигенраспознающего участка за счет процессов рекомбинации и взаимодействия двух V-доменов - остается общим.
Генетический контроль структуры Т-клеточного антигенраспознающего рецептора
Организация генов, кодирующих а- и B-цепи TCR, в основном гомологична той, которая известна для легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов. V-домен ос-цепи, подобно легкой цепи иммуноглобулинов, контролируется только V- и J-генными сегментами. В то же время образование V-домена B-цепи, как и тяжелой цепи иммуноглобулинов, обеспечено полным набором V-, D-, J-генных сегментов.
В геноме Т-клеток имеется более 100 V-генов для а-цепи TCR, что в два с половиной раза меньше того количества, которое известно для легких цепей иммуноглобулинов.
Каждый такой ген включает два экзона - один для лидерной (L) последовательности, отсутствующей у зрелой а-цепи, но представленной у этойцепи в момент ее транспорта из эндоплазматического ретикулума к клеточной поверхности, и второй - для кодирования собственно V-домена TCR. J-генных сегментов для а-цепи значительно больше, чем для легкой цепи иммуноглобулинов (100 против 4). Константная область а-цепи контролируется С-геном, включающим отдельные экзоны для С-домена и шарнира и один общий экзон - для трансмембранной и хвостовой частей молекулы.
Количество V-генов для B-цепи равно 30. Кроме того, имеется два кластера DJC. Каждый кластер включает один D- и шесть активных J-генных сегментов. Функциональные различия между кластерами неизвестны. С-ген для константной области B-цепи включает четыре экзона для константного, шарнирного, трансмембранного и хвостового участков полипептида. Процессы рекомбинации, транскрипции, сплайсинга и трансляции генетического материала для а- и Р-цепей при образовании TCR в Т-клетках аналогичны тем, которые обеспечивают синтез иммуноглобулинов в В-клетках.
Так же как и в случае с иммуноглобулинами и иммуноглобулиновыми рецепторами, вариабельность TCR зависит от случайного взаимодействия генных сегментов в процессе рекомбинации генетического материала, кодирующего V-домены: VJ - для а-цепей и VDJ - для B-цепей, а также за счет тех дополнительных изменений, которые, как и в случае с BCR, сопровождают рекомбинацию. Исключение составляет отсутствие соматического мутагенеза в V-генах. Расчет вариабельности V-доменов TCR, который проводится так же, как и для иммуноглобулинов, показывает крайне высокий уровень разнообразия этих антигенраспознающих структур. Так, только наличие в геноме нерекомбинированных V-, D- и J-генных сегментов дает потенциально (без учета модификаций при реорганизации) 2,8 106 вариантов.
Иммуноглобулины и иммуноглобулиновые рецепторы В-клеток распознают нативные антигенные эпитопы. В связи с этим отдельные участки антигенраспознающего центра имеют равные шансы на изменчивость. Ситуация с TCR несколько иная, поскольку этот рецептор распознает комплекс антигенного пептида с молекулами МНС.
Разнообразие TCR связано в значительной степени с третьей петлей V-домена, формируемой третьим гипервариабельным участком - CDR3 (от англ. - complementarity determining region). При образовании антигенсвязующего центра CDR3 оказываются в его внутренней части. Первая и вторая петли - CDR1 и CDR2 - занимают соответственно периферию центра. В таком конформационном построении имеется вполне определенный биологический смысл, связанный с адаптацией TCR к той форме иммуногена, с которой он взаимодействует. Антигенные пептиды заполняют пространство (щель), образованное а-спиральными структурами молекул МНС, и таким образом оказываются в середине антигенного комплекса пептид: МНС. Подобный комплекс характеризуется огромным множеством антигенных специфичностей, связанных с пептидами, и ограниченным разнообразием, свойственным молекулам МНС. В связи с подобной организацией иммуногенного комплекса следует ожидать повышенную изменчивость CDR3 и меньшую изменчивость CDR1 и CDR2. Изучение генетической организации генов для TCR подтверждает подобную точку зрения. Так, TCR имеет значительно меньшее по сравнению с иммуноглобулинами количество V-генов, определяющих специфичность CDR1 и CDR2, но при этом увеличенное число J-cer-ментов, принимающих участие в кодировании CDR3.Антигенраспознающие рецепторы и сопутствующие белки в процессе активации Т-клеток
TCR, как и мембранный антигенраспознающий иммуноглобулин В-клеток, имеет очень короткий цитоплазматический хвост. В связи с этим сигнал от взаимодействия TCR с комплексом пептид: молекулы МНС не может быть передан внутрь клетки. Трансмиссивную функцию выполняют инвариантные, низкомолекулярные, ассоциированные с TCR белки, которые получили общее название - CD3. Комплекс CD3 включает пять белков: белки CD3y, CD3b и CD3e представлены на клеточной поверхности и имеютопределенную гомологию с иммуноглобулинами, цитоплазматические белки CD3? и CD3n не имеют такой гомологии.
Белки, гомологичные иммуноглобулинам, экспрессируются на клеточной поверхности в виде гетеродимеров CD3e6 и CD3ey Их связь с TCR осуществляется посредством электростатического притяжения. Отрицательно заряженные трансмембранные участки цепей CD3 взаимодействуют с несущими положительный суммарный заряд трансмембранными участками TCR. Наличие длинного хвоста позволяет им взаимодействовать с цитоплазматическими белками-трансдукторами после получения антигенного сигнала.
Два других полипептида - CD3t и CD3n - также входят в состав комплекса в виде димеров СС или Сn- Около 80 % TCR ассоциировано с гомодимером и только 20 % с гетеродимером. Функциональные различия между ними неизвестны. Основной домен этих белков в отличие от других СОЗ-белков находится в цитоплазме. Именно головная, а не хвостовая часть С и n взаимодействует в цитоплазме с белками-трансдукторами.
Помимо сигналпередающей функции белки CD3 ответственны за транспорт TCR к клеточной поверхности. У мутантных клеток, в которых отсутствует синтез у-, b- или е-цепей, экспрессия TCR полностью подавлена, хотя внутриклеточный синтез этих рецепторов не нарушен. При мутациях гена С-цепи выход TCR на клеточную поверхность происходит в меньшей степени по сравнению с нормой. Как трансмиссивная, так и транспортная функции CD3 белков гомологичны той, которая характерна для Iga-и Igp-белков иммуноглобулинового, антигенраспознающего комплекса.
В активации Т-клеток, распознавших антиген, принимают участие также корецепторы CD4 и CD8 - маркеры дифференцировки Т-клеток. Как уже отмечалось, первый из них является маркером CD4+ Т-клеток, второй - цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+ Т-клеток). Долгое время функция этих белков оставалась неизвестной. Оказалось, что они принимают самое непосредственное участие в процессе взаимодействия TCR с соответствующим лигандом в качестве корецептора.
CD4 представляет собой одноцепочечную молекулу, состоящую из четырех иммуноглобулинподобных доменов (рис. 4.9). Домены D1 и D2, а также D3 и D4 образуют между собой парные, плотноупакованные, жесткие структуры. Эти пары соединены гибким шарнирным участком. Хвостовая часть молекулы CD4 имеет достаточную длину для взаимодействия с цитоплазматическими белками-трансдукторами. На клеточной поверхности TCR и CD4 представлены независимо друг от друга. Их встреча происходит в процессе формирования ответа на антиген. После распознавания TCR антигенного комплекса происходит взаимодействие CD4 с молекулой II класса МНС. Реакция взаимодействия осуществляется между В2-доменом молекулы II класса МНС и первым доменом CD4. Предполагается также слабое включение во взаимодействие и второго домена D2.
Аналогичная картина наблюдается при распознавании антигенного комплекса цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ). Действующие участники взаимодействия - TCR цитотоксических Т-лимфоцитов, комплекс пептида с молекулой I класса МНС и маркер цитотоксических Т-лимфоцитов - CD8. CD8, хотя и выполняет сходную с CD4 функцию корецептора, структурно отличается от маркера Т-хелперов. Он представляет собой гетеродимер, каждая цепь которого включает один иммуноглобулинподобный домен и достаточно длинный, связанный с мембраной участок цепи, который подвержен значительным конформационным изменениям. Так же как и CD4, CD8 представлен на клеточной мембране независимо. Его функция корецептора реализуется в процессе антигенного распознавания. После взаимодействия TCR с антигенным лигандом происходит контакт а- и Р-доменов CD8 с а3-доменом молекулы I класса МНС. Образовавшийся молекулярный комплекс является условием передачи через корецептор CD8 сигнала внутрь клетки.
Внутриклеточные события, определяющие активацию Т-клеток, аналогичны тем, которые происходят в В-клетках после антигенной стимуляции. Образовавшийся агрегат из антигенпредставляющих молекул МНС, Т-клеточного рецепторного комплекса, включающего CD3 молекулы, и CD4 или CD8 молекул провоцирует внутриклеточное взаимодействие различных тирозинкиназ с цитоплазматической частью полипептидов. Среди СDЗ-белков наибольшей связывающей активностью обладает CD3?, представленный в цитозоле не хвостовой, а головной частью. Активированные в результате взаимодействия киназы обеспечивают каскад реакций, следствием которых является индукция специфической транскрипции генов. Среди генов, вступивших в процесс транскрипции, особое место занимают те, которые кодируют синтез Т-зависимых цитокинов (в частности, ИЛ-2). В конечном счете цепь событий от взаимодействия TCR с антигенным комплексом и образования сложного молекулярного агрегата до внутриклеточных реакционных преобразований приводит к пролиферации.
В- и Т-клетки обладают самостоятельными антигенраспознающими рецепторами, относящимися к одному и тому же суперсемейству иммуноглобулинов. Антигенраспознающие рецепторы В-клеток (BCR) представляют собой мономерную форму IgM, модифицированную дополнительной последовательностью аминокислотных остатков в С-концевой части молекулы. Эта последовательность составляет трансмембранный и хвостовой участки тяжелой цепи. Т-клеточный антигенраспознающий рецептор (TCR) состоит из двух полипептидных цепей, каждая из которых включает два домена: V и С. Механизм генетического контроля V-доменов как BCR, так и TCR в целом сходен и включает процесс случайной рекомбинации генных сегментов (V, D, J). Несмотря на то что функциональное предназначение антигенраспознающих рецепторов двух типов клеток одно и то же (распознавание чужеродности), реализация такой функции В- и Т-клетками осуществляется разными способами. В то время как slg В-клеток распознает собственно антигенную детерминанту без каких-либо дополнительных условий, TCR Т-клеток способен распознать только комплекс антигенной детерминанты с собственными молекулами I или II класса МНС.
Т-клеточные рецепторы (англ. TCR) - поверхностные белковые комплексы Т-лимфоцитов, ответственные за распознавание процессированных антигенов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (англ. MHC) на поверхности антиген-представляющих клеток. TCR состоит из двух субъединиц, заякоренных в клеточной мембране и ассоциирован с многосубъединичным комплексом CD3. Взаимодействие TCR с MHC и связанным с ним антигеном ведет к активации Т-лимфоцитов и является ключевой точкой в запуске иммунного ответа.
TCR представляет собой гетеродимерный белок, состоящий из двух субъединиц - α и β либо γ и δ, представленных на поверхности клетки. Субъединицы закреплены в мембране и связаны друг с другом дисульфидной связью.
По своей структуре субъединицы TCR относятся к суперсемейству иммуноглобулинов. Каждая из субъединиц образована двумя доменами с характерной иммуноглобулиновой укладкой, трансмембранным сегментом и коротким цитоплазматическим участком.
N-концевые домены являются вариабельными (V) и отвечают за связывание антигена, презентируемого молекулами главного комплекса гистосовместимости. В составе вариабельного домена содержится характерный для иммуноглобулинов гипервариабельный участок (CDR). За счет необычайного разнообразия данных участков, различные Т-клетки способны распознавать широчайший спектр различных антигенов.
Второй домен - константный (C) и его структура одинакова у всех субъединиц данного типа у конкретной особи (за исключением соматических мутаций на уровне генов любых других белков). На участке между С-доменом и трансмембранным сегментом имеется остаток цистеина, с помощью которого между двумя цепями TCR образуется дисульфидная связь.
Субъединицы TCR агрегированы с мембранным полипептидным комплексом CD3. CD3 образован четырьмя типами полипептидов - γ, δ, ε и ζ. Субъединицы γ, δ и ε кодируются тесно сцепленными генами и имеют близкую структуру. Каждая из них образована одним константным иммуноглобулиновым доменом, трансмембранным сегментом и длинной (до 40 аминокислотных остатков) цитоплазматической частью. Цепь ζ имеет маленький внеклеточный домен, трансмембранный сегмент, и большой цитоплазматический домен. Иногда вместо цепи ζ в состав комплекса входит цепь η - более длинный продукт того же гена, полученный путем альтернативного сплайсинга.
Поскольку структура белков комплекса CD3 инвариантна (не имеет вариабельных участков), они не способны определять специфичность рецептора к антигену. Распознавание является исключительно функцией TCR, а CD3 обеспечивает передачу сигнала в клетку.
Трансмембранный сегмент каждой из субъединиц CD3 содержит отрицательно заряженный аминокислотный остаток, а TCR – положительно заряженный. За счет электростатических взаимодействий они объединяются в общий функциональный комплекс Т-клеточного рецептора. На основании стехиометрических исследований и измерения молекулярной массы комплекса наиболее вероятным его составом является (αβ)2+γ+δ+ε2+ζ2.
TCR, состоящие из αβ-цепей и γδ-цепей весьма близки по структуре. Эти формы рецепторов по-разному представлены в различных тканях организма.
Структура рецептора Т-лимфоцита во многом напоминает структуру молекулы антитела. Молекулы Т-клеточных рецепторов (ТКР) состоят из двух цепей - а и р. Каждая из них содержит V- и С-домены, их структура закреплена дисульфидными связями. Вариабельные домены а- и р-цепей имеют не 3-4, как у антител, а не менее 7 гипервариабельных участков, которые формируют активный центр рецептора. За С-доменами, около мембраны, располагается шарнирная область из 20аминокислотных остатков. Она обеспечивает соединение а- и р-цепей с помощью дисульфидных связей. За шарнирной областью располагается трансмембранный гидрофобный домен из 22 аминокислотных остатков, он связан с коротким внутрицитоплазматичеким доменом из 5-16 аминокислотных остатков. Распознавание Т-клеточным рецептором представляемого антигена происходит следующим образом. Молекулы МНС классаП, как и рецепторы Т-лимфоцитов, состоят из двух полипептидных цепей - а и р. Их активный центр для связывания представляемых антигенных пептидов имеет форму «щели». Она формируется спиральными участками а- и р-цепей, соединенными на дне «щели» между собой неспиральной областью, образованной сегментами той и другой цепи. В этом центре (щели) молекула МНС присоединяет процессированный антиген и таким образом представляет его Т-клеткам (рис. 63). Активный центр Т-клеточного рецептора образуется гипервариабельными участками а- и р-цепей. Он также представляет собой своеобразную «щель», структура которой соответствует пространственной структуре представляемой молекулой МНС классаП пептидного фрагмента антигена в такой же степени, как структура активного центра молекулы антитела соответствует пространственной структуре детерминанта антигена. Каждый Т-лимфоцит несет рецепторы только для одного какого-то пептида, то есть специфичен в отношении конкретного антигена и связывает процессированный пептид только одного типа. Присоединение представляемого антигена к Т-клеточному рецептору индуцирует передачу сигнала от него на геном клетки.
Для функционирования любого ТКР необходим его контакт с молекулой CD3. Она состоит из 5субъединиц, каждая из которых кодируется своим геном. Молекулы CD3 имеют все субклассы Т-лимфоцитов. Благодаря взаимодействию Т-клеточного рецептора с молекулой CD3 обеспечиваются следующие процессы: а)вынос ТКР на поверхность мембраны Т-лимфоцита; б)придание соответствующей пространственной структуры молекуле Т-клеточного рецептора; в)прием и передача сигнала Т-клеточным рецептором после его контакта с антигеном в цитоплазму, а затем в геном Т-лимфоцита через фосфатидилинозитольный каскад с участием посредников.
В результате взаимодействия молекулы МНС классаП, несущей антигенный пептид, с рецептором Т-лимфоцита пептид как бы встраивается в «щель» рецептора, которую образуют гипервариабельные участки а- и р-цепей, контактируя при этом с той и другой цепью
Организация генов, кодирующих а- и (3-цепи ТКР, в основном гомологична той, которая известна для легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов. V-домен a-цепи, подобно легкой цепи иммуноглобулинов, контролируется только V- и J-генными сегментами. В то же время образование V-домена (3-цепи, как и тяжелой цепи иммуноглобулинов, обеспечено полным набором V-, D-, J- генных сегментов (рис. 3.14).
В геноме Т-клеток имеется более 100 V-генов для а-цепи
ТКР, что в два с половиной раза меньше того количества, которое известно для легких цепей иммуноглобулинов. Каждый такой ген включает два экзона - один для лидерной (L) последовательности, отсутствующей у зрелой a-цепи, но представленной у этой цепи в момент ее транспорта из эндоплазматического ретикулума к клеточной поверхности, и второй - для кодирования собственно V-домена ТКР. J-Генных сегментов для a-цепи значительно больше, чем для легкой цепи иммуноглобулинов (50 против 4). Константная область a-цепи контролируется С-геном, включающим отдельные экзоны для С-домена, шарнира и один общий экзон - для трансмембранной и хвостовой частей молекулы.
Количество V-генов для (3-цепи равно 30. Кроме того, имеется два кластера DJC. Каждый кластер включает один D- и шесть J-генных сегментов. Функциональные различия между кластерами неизвестны. С-ген для константной области |3-цепи включает четыре экзона для константного, шарнирного, трансмембранного и хвостового участков полипептида.
Процессы рекомбинации, транскрипции, сплайсинга и трансляции генетического материала для а- и (3-цепей при образовании ТКР в Т-клетках аналогичны тем, которые обеспечивают синтез иммуноглобулинов в В-клетках.
Так же как в случае с иммуноглобулинами и иммуноглобулиновыми рецепторами, вариабельность ТКР зависит от случайного взаимодействия генных сегментов в процессе рекомбинации генетического материала, кодирующего V-домены: VJ - для и- цепей и VDJ -для (3-цепей. Расчет вариабельности V-доменов ТКР, который проводится так же, как и для иммуноглобулинов (см. гл.
- , показывает крайне высокий уровень разнообразия этих анти-
На первом этапе работы от мышей, иммунизированных опеределенным антигеном (АГ), получали суммарную, недифференцированную популяцию Т-кле- ток, содержащую самые различные клоны (на рис. цифры 1 -6). Второй этап состоял в выделении отдельных клонов Т-клеток, среди которых были и специфичные к использованному антигену (на рис. в качестве примера приведено четыре клона, один из которых - клон 3, - специфически реагирует с антигеном). Третий этап работы включал получение моноклональных антител (мАТ) к антигенреактивно- му клону. Задача этого этапа - получение моноклональных антител, способных реагировать только с клоном, использованным для иммунизации. В то же время перекрестная реакция мАТ говорит об общей специфике антигенреактивного клона и непримированных клонов (верхняя таблица). Отсутствие перекрестной реактивности мАТ указывает на наличие у положительно реагирующего примирован- ного клона особой специфичности - предположительно, антигенраспознающего рецептора. Подтверждением подобного предположения является реакция задержки взаимодействия мАТ с соответствующим клоном в присутствии использованного антигена (нижняя таблица). Получение мАТ к антигенраспознающему рецептору Т-клеток создало условия для его полноценного изучения
Рис. 3.13. Структура янтнгецрвсооamp;яощсго рецсширя Т-влето*.
Т-клеточный антигенраспознающий рецептор (ТКР) представляет собой гетеродимер, составленный из а- и p-цепей. Каждая цепь включает два домена: вариабельный (V) и константный (С). Взаимодействующие Va- и Ур домены формируют антигенраспознающий участок ТКР. Помимо основных V- и С-доменов в структуре ТКР имеется шарнирная область с цистеиновым остатком, образующим ковалентную связь между а- и p-цепями, а также трансмембранный и короткий хвостовой участки
генраспознающих структур (табл. 3.2). При общем сходстве организации и рекомбинации генетического материала для иммуноглобулинов и ТКР следует отметить и некоторые особенности в контроле специфичности этих молекул.
Иммуноглобулины и иммуноглобулиновые рецепторы 6-клеток распознают нативные антигенные эпитопы. В связи с этим отдельные участки антигенраспознающего центра имеют равные шансы на изменчивость. Ситуация с ТКР несколько иная, поскольку этот рецептор распознает комплекс антигенного пептида с молекулами МНС.
Разнообразие ТКР связано в значительной степени с третьей петлей V-домен а, формируемой третьим гипервариабельным участком - CDR3 (сокр. от англ, “complementarity determining region”). При образовании антигенсвязывающего центра V-доме- нами а- и 0-цепей CDR3 оказываются во внутренней части этого центра. Первая и вторая петли (CDR1 и CDR2, соответственно) занимают периферию центра. В таком конформационном построе
на
Рис. 3.14. Ортшнзацп геоон, контролирующих а- и р-цеш Т-исшюго рецытгоц.
Принцип реорганизации генных сегментов, контролирующих а- и р-цспи ТКР, таг же, что и для иммуноглобулинов. Отличие состоит в том, что локус для (3-цепи имеет два идентичных кластера. В чем функциональное значение такого дублирования, неизвестно
Таблица 3.2
Вариабельность Т-клеточных рецепторов в сравнении с
иммуноглобулиновыми рецепторами и иммуноглобулинами
нии имеется вполне определенный биологический смысл, связанный с адаптацией ТКР к той форме антигена, с которой он взаимодействует. Как уже отмечалось, антигенные пептиды заполняют пространство (щель), образованное а-спиральными структурами молекул МНС и таким образом оказываются в середине антигенного комплекса пептидгМНС. Подобный комплекс характеризуется огромным множеством антигенных специфичностей, связанных с пептидами, и ограниченным разнообразием, свойственным молекулам МНС. В связи с подобной организацией иммуногенного комплекса следует ожидать повышенную изменчивость CDR3 и меньшую изменчивость CDR1 и CDR2. Изучение генетической организации генов для ТКР подтверждает подобную точку зрения. Так, ТКР имеет значительно меньшее по сравнению с иммуноглобулинами количество V-генов, определяющих специфичность CDR1 и CDR2, но, при этом увеличенное число J-сегментов, принимающих участие в кодировании CDR3 (см. табл. 3.2). На рис. 3.15 представлена упрощенная схема, иллюстрирующая взаимодействие СОЮ с пептидом и CDR1 и CDR2 - с а-спиральной последовательностью молекул МНС.
